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Western Blot常见问题及解答
点击次数:6次 发布时间:2020-01-15 返回

        免疫印迹,通常也叫Western Blot,是一种蛋白研究的基本技术,虽然每个实验室都有自己的方法,但基本的步骤大致相同,然而,对一种应用的熟悉,并不保证会得到干净又可发表于文献的结果,获得无背景值的漂亮信号常常需要系统性的问题排除,才能够快速且正确的改善糟糕结果,因此,我们将免疫印迹整个过程中可能刚出现的问题列出来,并针对这些问题提供解决方案。

问题

可能的原因

验证或解决方法

转膜不充分

膜没有完全均匀湿透

使用100%甲醇浸透膜

靶蛋白分子量小于10kDa

选择小孔径的膜,缩短转移时间

靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液PH值

可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液(PH10.5)或使用低PH值缓冲液如乙酸缓冲液

甲醇浓度过高

过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离,从而沉淀在凝胶中,同时会使凝胶收缩或变硬,从而抑制高分子量蛋白的转移,降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替

转移时间不够

对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间

背景高

膜没有完全均匀湿透

使用100%甲醇浸透膜

洗膜不充分

增加洗液次数和洗液体积

封闭不充分

增加封闭液孵育时间,或者提高温度,选择合适的封闭试剂(脱脂奶粉,BS,,酪蛋白等)

二抗浓度过高

降低二抗浓度

检测过程中膜干燥

保证充分的反应液,避免出现干膜现象

曝光过度

缩短曝光时间

抗体与封闭蛋白有交叉反应

检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性,选择无交叉反应的封闭剂,洗涤剂中加入Tween-20可减少交叉反应

二抗的非特异性背景

增加一个二抗对照:不加一抗,其它条件不变,即可验证背景是否有二抗系统来源。选择其它二抗(特异性更强的,只针对重链)

无信号

抗体染色不充分

增加抗体浓度,延长孵育时间

酶失活

直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明失活,选择在有效期内有活性的酶联物

标本中不含靶蛋白或靶蛋白蛋白太低

设置阳性对照,如果阳性对照,

试剂之间不匹配

一抗与标本种属,一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配,通过设置内参可以验证二级检测系统的有效性

一抗失效

选择有效期内抗体,并选择现配现用的工作液

HRP抑制剂

所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠

弱信号

抗体染色不充分

增加抗体浓度,延长孵育时间

酶活性降低

直接将酶和底物进行混合,如果显色弱则说明酶活性降低了。选择在有效期内,有活性的酶联物

标本中靶蛋白含量太低

增加标本上样量

洗膜过度

缩短洗涤时间和次数

抗体活性降低

选择在有效期内的抗体,工作液现配现用,避免长时间放置

封闭过度

较少封闭剂的量或缩短时间;更换不同封闭类型

曝光时间过短

延长曝光时间

HRP抑制剂

所用溶液和容器中避免含有叠氮钠

非特异性条带(多条带)

二抗的非特异性结合

增加一个二抗对照(不加一抗,其它操作不变)即可验证背景是否由二抗系统来源;选择其它二抗(特异性更强的,只针对重链)

一抗特异性不够

使用单克隆或者亲和纯化抗体,保证抗体的特异性

蛋白降解

使用新鲜制备的抗体,并使用蛋白酶抑制剂

抗体浓度过高

降低抗体(一抗、二抗)浓度,可以减少非特异性条带

不同剪切体的存在

有些来源于同一基因的蛋白有不同的剪切方法,每个剪切方式得到的蛋白大小都是不同的

细胞传代过多导致蛋白变异

使用原代或传代的细胞作对照

蛋白上样量过大

降低上样量

条带大小不对

二聚体或多聚体存在

增加蛋白质变性过程及强度

翻译后剪切

比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的,在执行功能是需要进行剪切成活化的形式,如procaspases

蛋白修饰

比如氨基化、磷酸化等修饰状态回导致蛋白分子量增加

背景有黑色斑点

封闭试剂中有聚集体

使用前过滤封闭试剂

孵育液中有聚集体

使用前过滤孵育液

抗体和封闭试剂反应

使用前过来吧封闭试剂

HRP偶联二抗中有聚集体

过滤二抗试剂

背景有不均匀的白色斑点

转膜过程中有气泡产生

仔细检查,避免存在气泡

抗体分布不均匀

孵育抗体时使用摇床

微小条带

电泳速度过快

减少电压减慢电泳速度

电泳速度过高

在冷室或冰浴中进行电泳,改变电泳PH值

膜出现反像(白色带)

HRP含量过高

降低酶联二抗浓度

Marker变黑色

抗体和marker蛋白反应

在marker和sample之前空出一个孔不上样

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